Sequenciamento de DNA

DEFINIÇÃO:

É um processo que determina a ordem dos nucleotídeos.

Produziu uma grande quantidade de informação quanto à arquitetura do gene.

PIONEIROS:

                                                        Alan Maxam

                                                       Walter Gilbert

                                                FREDERICK SANGER

MÉTODOS:

-Pirosequenciamento

-Sequenciamento de hibridação

-Colônias da polimerase

-Sequenciamento por nanoporos

-Espectrometria de massa

-Massively parallel signature seuqencing

-Método Didesoxi (Sanger)

-Método de degradação química.

MÉTODO DIDESOXI (SANGER):

-Identifica continuamente e sequencialmente durante o processo, o último nucleotídeo incorporado na extremidade de alongamento da cadeia.

-É realizado a partir de uma cadeia simples, e não dupla do DNA a ser sequenciado.

SANGER:

Utiliza o análogo de ddNTP (Didesoxinucleosídeos trifosfatos) para interromper a síntese de DNA.

ddNTP:

-Não possui o grupo 3’- hidroxila necessário para a próxima etapa do alongamento da fita de DNA.

-FITA INICIADORA: fita olinucleotídica curta à qual os nucléotidios são adicionados

-FITA-MOLDE: Guia a seleção do nucleotídio novo – DNA a ser sequenciado.

5' - OH INICIADOR                

3' - CTAGCTCGACT MOLDE

                                                   +

                                +ddATP +ddCTP +ddGTP +ddTTP

Sequenciamento automático:

-Síntese química do DNA COM QUALQUER SEQUENCIA ESCOLHIDA.

-O refinamento e a automoção desses métodos tornaram possível a síntese rápida e acurada de fitas de DNA.

APLICAÇÕES:

-Análise genômica

-Genomas inteiros de muitos organimos têm sido sequenciados.

-PROJETO GENOMA HUMANO: 3,2 bilhões de pares de DNA em uma célula humana.

-Análise genômica

-ciência forense

-Análise filogenética

-Conservação das espécies

-Epidemias virais